蛋白穩(wěn)定性分析儀PSA-16助力齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所的科研工作者于 2025年4月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上發(fā)表“Structural-guided high stable fusion urate oxidase engineering to self-assemble with cellulose modified electrode for enhanced uric acid sensing”論文。

Xingbao Wang, Weili Gong, Yunlong Xue, Yi Yu, Xiaozhen

01 前言

在固定化尿酸氧化酶（UOX）的高穩(wěn)定性和保留的催化活性是實(shí)現(xiàn)尿酸（UA）精確傳感器的關(guān)鍵。本研究開發(fā)了一種基于自組裝固定化UOX的電化學(xué)UA生物傳感器，通過在纖維素修飾電極上融合碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）來促進(jìn)UA的檢測。借助計(jì)算結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的酶工程策略，證明了N端CBM3融合的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)于C端融合的CBM3或CBM2。進(jìn)一步刪除了預(yù)測對CBM3-UOX結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有害的CBM3 N端殘基（P2VSG5）和連接區(qū)殘基（K158EPMSN163），構(gòu)建了CBM3-Δ10aa-UOX，與戊二醛交聯(lián)的UOX生物傳感器（0-0.375 mM，5天）相比，顯著提高了UA生物傳感器的可靠性，在0至0.625 mM UA范圍內(nèi)表現(xiàn)出線性關(guān)系，R2 > 0.99，可持續(xù)20天。此外，通過野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的共固定化（0-0.875 mM，> 34天，R2 > 0.99），探究了融合UOX在初始階段電流增加的機(jī)制，并將其歸因于UOX亞基之間的相互作用和連接肽斷裂，進(jìn)一步證明了CBM3-Δ10aa-UOX連接肽的增強(qiáng)穩(wěn)定性可延長電流增加過程并提高工作壽命。本研究強(qiáng)調(diào)了自組裝固定化在推進(jìn)生物傳感器領(lǐng)域的有效性，并為類似多聚體生物傳感器的進(jìn)化提供了穩(wěn)健的策略。

02 摘要

尿酸（UA）是一種在血清和尿液等生物體液中廣泛存在的關(guān)鍵含氮化合物，是嘌呤代謝的主要終產(chǎn)物。健康個(gè)體血清中UA的正常水平分別為成年男性約0.21-0.43 mM和成年女性約0.15-0.36 mM，而在痛風(fēng)患者中，UA濃度可高達(dá)1.49-4.46 mM。生物體液中UA水平的異常可提示痛風(fēng)、代謝綜合征和腎臟疾病等疾病，使其成為檢測嘌呤代謝相關(guān)疾病的有用生物標(biāo)志物。因此，生物體液中UA的快速可靠檢測通常對其診斷和治療至關(guān)重要。

目前，已開發(fā)出多種UA測定方法，包括高效液相色譜法（HPLC）、分光光度法、離子色譜法、HPLC/同位素稀釋質(zhì)譜法（ID-MS）和電化學(xué)生物傳感方法。在這些方法中，基于尿酸氧化酶（UOX或尿酸酶，EC 1.7.3.3）氧化還原催化的電流型酶生物傳感器因其簡單性、靈敏度、特異性和快速響應(yīng)而受到廣泛研究關(guān)注。UOX反應(yīng)方程式如下：UA + 2H2O + O2 → 尿囊素 + H2O2 + CO2。在生物傳感過程中，固定在電極上的UOX與UA反應(yīng)，消耗O2并產(chǎn)生H2O2。減少的O2或氧化的H2O2與UA濃度成正比，氧化或還原信號可通過換能器和電子放大器轉(zhuǎn)換并放大為可讀的物理信號。因此，固定化UOX的高穩(wěn)定性和保持的催化活性是實(shí)現(xiàn)UA精確傳感的關(guān)鍵。

在先前報(bào)道的研究中，已利用不同類型的酶固定化技術(shù)構(gòu)建電流型UA生物傳感器。物理吸附和包埋法常用于UOX固定化，但其吸附過程的結(jié)合力較弱，易受環(huán)境變化影響，從而降低相應(yīng)生物傳感器的操作和儲存穩(wěn)定性。UOX包埋通常使用聚苯胺（PANi）和聚吡咯等聚合物實(shí)現(xiàn)。然而，固定化酶從這些聚合物中的泄漏可能影響其穩(wěn)定性。使用戊二醛或碳二亞胺等雙功能試劑在酶與載體或牛血清白蛋白（BSA）之間形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的共價(jià)結(jié)合和交聯(lián)方法也是化學(xué)固定UOX的常用方法，可避免酶的解吸和泄漏。然而，共價(jià)結(jié)合法引起的廣泛酶失活和低重復(fù)性限制了其在生物傳感器中的應(yīng)用。最近，親和吸附法已被證明是一種有前景的酶固定化策略，可提高酶生物傳感器的性能。此外，通過基因工程將來自家族2的碳水化合物結(jié)合模塊（CBM2）與葡萄糖氧化酶融合，以促進(jìn)葡萄糖傳感性能。然而，UOX的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制與葡萄糖氧化酶不同，因此探索構(gòu)建穩(wěn)定且具有活性的CBM融合UOX作為UA生物傳感元件仍然至關(guān)重要。

UOX是一種功能性四聚體桶狀結(jié)構(gòu)，其活性位點(diǎn)由來自兩個(gè)單體的界面殘基形成。每個(gè)單體包含兩個(gè)具有ββααββ反平行超二級結(jié)構(gòu)的相同結(jié)構(gòu)域，稱為隧道折疊結(jié)構(gòu)域。某些弱相互作用（非共價(jià)鍵、次級鍵），包括范德華力、氫鍵、鹽鍵（解離鍵）和疏水相互作用，參與穩(wěn)定四級結(jié)構(gòu)。此外，亞基之間形成的緊密界面處極性和疏水基團(tuán)的互補(bǔ)排列促進(jìn)了特定亞基的關(guān)聯(lián)。在UOX催化過程中，采用無輔因子方式促進(jìn)和控制O2化學(xué)，提出了類似于黃素依賴性氧化酶或黃素依賴性單加氧酶的不同催化機(jī)制，但其作用機(jī)制尚未闡明。由于UOX的多亞基依賴性催化活性和模糊的催化機(jī)制，過去幾十年中關(guān)于性能改進(jìn)的工程化UOX的研究報(bào)道較少。因此，構(gòu)建穩(wěn)定的基因融合UOX是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。

串聯(lián)融合是構(gòu)建合成融合蛋白的一種流行且可行的策略。使用該策略獲得理想的融合蛋白時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮兩個(gè)的要素：融合伙伴之間的最佳結(jié)構(gòu)域放置順序和選擇合適連接子將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接在一起。融合蛋白的盲目設(shè)計(jì)可能導(dǎo)致多種不良后果，包括結(jié)構(gòu)域錯(cuò)誤折疊、蛋白質(zhì)產(chǎn)量低和生物活性降低。由于專門用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和蛋白質(zhì)合理設(shè)計(jì)的計(jì)算程序（如AlphaFold2、PROCHECK、AutoDock Vina和GROMACS ）的顯著發(fā)展，可以更好地理解融合蛋白結(jié)構(gòu)并避免許多不良結(jié)果。

03 結(jié)果

為了對所有UOXs進(jìn)行更全面的結(jié)構(gòu)表征，作者采用了差示掃描熒光法（DSF）[34]進(jìn)行熱穩(wěn)定性測定。如圖S7所示，UOX-CBM3和UOX-CBM2的峰形更為不對稱，尤其是UOX-CBM2，這表明CBM與UOX斷裂誘導(dǎo)了多個(gè)結(jié)構(gòu)域的協(xié)同變性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX的DSF峰最為對稱且最窄，驗(yàn)證了其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這與分子動力學(xué)模擬和SDS-PAGE分析的結(jié)果一致。

04 方法

使用北京佰司特科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)的 PSA-16 蛋白穩(wěn)定性分析儀對目標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了評估。首先將樣品稀釋至 0.5 毫克/毫升的濃度。然后，將 20 微升稀釋后的樣品置于石英玻璃管（產(chǎn)品編號 LG-002，同樣來自北京佰司特科技有限責(zé)任公司）中。

采用線性溫度掃描法，測量 330 nm和 350 nm處的內(nèi)源性蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度。溫度范圍為 23 至 97 ℃，升溫速率為每分鐘 1 ℃。根據(jù) F350/F330 曲線的斜率計(jì)算出熱變性中點(diǎn)溫度（Tm）。每個(gè)樣品均重復(fù)測量四次。

05 結(jié)果

在本研究中，作者借助結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的酶工程策略構(gòu)建了一系列CBM融合尿酸氧化酶，并探索了影響融合UOX作為生物傳感元件穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，結(jié)果表明CBM3 N端連續(xù)殘基（P2、V3、S4、G5）和158至163位（K158EPMSN163）域間錨定區(qū)域?qū)BM融合UOX結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)鍵作用。刪除不穩(wěn)定殘基后，UA生物傳感器的可靠性顯著提高。本研究有助于合理構(gòu)建具有可調(diào)和可預(yù)測特性的融合UOX，并為制造優(yōu)異的UA生物傳感器提供了理想候選者。

為了對所有 UOX 進(jìn)行更全面的結(jié)構(gòu)表征，作者使用差示掃描熒光法（DSF）[34] 進(jìn)行了熱穩(wěn)定性測定。如圖 S7 所示，UOX-CBM3 和 UOX-CBM2 的峰形更不對稱，尤其是 UOX-CBM2，這表明由于 CBM 和 UOX 的斷裂，多個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同變性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX 的差示掃描熒光（DSF）峰最對稱且最窄，這證實(shí)了其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，正如分子動力學(xué)（MD）模擬和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析所表明的那樣。